Mezenkimal öncül hücreler multi-potansiyel farklılaşma kapasitesine sahip hücrelerdir. Kas, kordon kanı, kemik, kıkırdak dokusu, tendon, yağ dokusu, pulpa ve dental Iigament gibi pek çok doku mezenkimal hücreleri ihtiva etmektedir. RNA ve DNA içerikleri, ebat ve granül miktarları incelendiğinde değişken alt kümeleri olan, dinlenme durumunda hareketsiz hücrelerdir.
Alt kültürleme sonrasında geniş, aynı zamanda son derece değişken çoğalım potansiyeline sahip oldukları gözlem­lenmiştir. 4-15 kez bölünebilirler. Normal karyotipik özelliklerini ve telomeraz etkinlikle­rini kaybetmezler.

 

Mezenkimal öncül hücreler yüksek fenotipik plastisiteye sahip olduğundan dolayı, fonksiyonları yüksek derecede topolojilerine ve substratların moleküler yapılarına, hüc­re yüzeyinde adezyon moleküllerin bulunmasına ve bağlantıdaki uyarıimış sinyalıerin transmembran transdüksiyonuna bağlıdır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, mezen­kimal öncül hücre farklılaşmasının yüzey doğasından direkt olarak etkilendiğini göster­mektedir.

 

Onkim Kök Hücre Teknolojileri Genel Direktörü, istanbul Teknik Üniversitesi KOSGEB Teknoloji Geliştirme Merkezi

 

Dendritik hücreler (DH) immün sistem hücreleridir. Antijen sunan hücrelerdir (ASH). Primer immun yanıtta yer alırlar ve T hücre aktivasyonunu sağlarlar. Oendritik hücreler bir antijen ile karşılaştıklarında ve onu tanıdıklarında antijeni yakalarlar. Vücutta, deri epiteli (Langerhans hücreleri olarak da bilinirler), burun, akci­ğer, mide ve bağırsakların iç cidarları gibi dış ortam ile temas eden dokularda bulunurlar. Kanda ise aktive olduktan sonra lenfoid dokulara göç ederler ve burada T ve B hücreleri ile etkileşirler. DH kemik iliğinde myelositer, (mDC) ve plasmositer (pDC) seriden köken alan farklı iki tipten oluşmaktadır.
 

Dendritik hücre eldesinde ilk aşama, gönüllü vericilerden allojenik kordon kanlarının toplanmasıdır. Kordon kanından mononükleer hücreler UCB (kordon kanı)-HES metodu (Sepax^R) kullanılarak izole edilirler. 2x10⁶ hücre doku kültür flasklarına ekilir. ilk kültür %10 fetal dana serumu ve 2 mM L-Glutamin içeren OMEM besiyeri ile muamele edilerek; 37°(, 5% CO₂ ortamda inkübe edilir. Hücrelerin gelişimi günlük olarak takip edilir. Olgunlaş­mamış dendritik hücreleri üretme süreci genellikle 5 gün sürerken, sonraki 2 gün içinde olgunlaşmış dendritik hücreler elde edilir. Biyolojik aktivitenin in vitro analizleri ve yüzey işaretleyiciler ile farklı fenotipler ayırt edilebilir. Olgunlaşmamış dendritik hücreler CD11 a, CD123 ve CD18 yüzey antijenlerine karşı; olgunlaşmış dendritik hücreler ise CD11 c ve CD80 yüzey antijenlerine karşı antikorlar ile inkübe edilerek flow sitometri de analizleri gerçekleştirilir. Hücre canlılığı akım sitometrisi, Viacell ve göz ile olmak üzere üç farklı şekilde sayılır. Fagositoz yetenekleri ve aktivasyonları kamera ile filme alınır.

 

Good Manufactoring Practice (GMP) yani iyi Üretim Uygulamaları (İÜU) uluslararası platformlarca üretici firmalar tarafından, uluslararası standartlarca belirlenen ve bekle­nen kaliteye ulaşmak için uygulanan bir grup prensip ve yöntemlerin tümü olarak tanımIanır. Genellikle Current Good Manufactoring Practice (cGMP), yani Güncel iyi Üretim Uy­gulamaları (giÜU) terimi kullanılır. İÜU, eş zamanlı olarak kontrol altında olan, yenilenen dinamik bir programdır.

 

GMP de kontrol, kalitenin sadece her ürün grubunun üretiminin son aşaması ile kal­mayıp, onun üretimin her aşamasında hatta üretim öncesi tasarlama aşamalarını bile gü­vence altına alır.

 

GMP, tüm üretim aşamalarından, ana maddelerden müştemilatın ve ekipmanların planlarına, personelin hijyeninden eğitimine kadar çok geniş bir alanı kapsar. Detaylı, standart çalışma yöntemi (SOP) hazırlanması, her üretim süreci için ürünün kalitesini et­kileyecek olduğundan çok önemlidir ve zorunludur. Üretim sürecinin her aşamasında, o aşamanın (kullanılan yöntemin, cihazların, maddelerin, vb.) beklenen şekilde sonuç ver­diğini kanıtlayan yazılı belgeler olmalıdır.
 

Mezenkimal hücreler kıkırdak, kemik, kas, tendon, Iigament ve yağ meydana getire­bilme yeteneğine sahip pluripotent öncü hücrelerdir. Bu hücrelerin özelleşmiş ve ayırı­cı fenotipe farklılaşması, özel hücresel değişimleri içermektedir. Mezenkimal hücrelerin şimdiye kadar kemik iliği ile yağ doku, sinovyal, iskelet kası, dermis, trabeküler kemik, in­san kordon kanı, akciğer, dişözü, amniyotik sıvı, fetal karaciğer ve hatta periferik kan gibi birçok farklı dokudan izole edilmesi, mezenkimal hücrelerin organizma içinde geniş bir şekilde yayıldığını göstermektedir. Biz çalışmalarımızda, mezenkimal hücreleri allojenik kordon kanından izole ettik.

 

Mezenkimal hücreler yüksek fenotipik plastisiteye sahip olduğundan dolayı, fonksiyonları yüksek derecede topolojilerine ve substratların moleküler yapılarına, hücre yüzeyinde adezyon moleküllerin bulunmasına ve bağlantıdaki uyarılmış sinyalleri n transmembran transdüksiyonuna bağlıdır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, yüzey do­ğasının direkt olarak mezenkimal hücre farklılaşmasını etkilediğini göstermektedir.

 

CD antijenleri hücre kökenlerini, gelişimsel aşamaları ve fonksiyonel altkümeleri ayırt etmek için lökositlertarafından eksprese edilen hücre yüzey işaretleyicilerdir. Kültüre edil­miş insan mezenkimal hücreleri CD45 ve CD34 eksprese etmezler. CD (+) ekspresyonları belli başlı tek bir grupta toplanmamakla birlikte, çok sayıda alındığı kaynağa bağlı olarak çeşitli yüzey belirleyiciler tespit edilmiştir. Bu yüzey belirleyiciler içinde en çok kabul göireni CD73:CD90 ve CD105 tir. Çalışmamızda mezenkimal hücreler bu yüzey antijenlerine 1 karşı antikorlar ile inkübe edilerek flow sitometri de analizleri gerçekleştirilecektir.

Dendritik hücreler en önemli antijen sunan bağışıklık sistemi hücrelerindendir. T ve B lenfositlerle etkileşimde bulunarak primer immün cevapta görev alırlar ve sonuç olarak adoptif immün cevabı başlatırlar. Dendritik hücreler ortaya çıkan cevabı şekillendirmede ve bundan dolayı enfeksiyonun seyrinin kontrolünde önemli roloynarlar. Çeşitli mikroor­ganizmalar arasında ayırım yapabilirler ve farklı mikrobiyal uyaranıara karşı cevapta farklı sitokinler üretme yeteneğine sahiptirler. Olgunlaşmamış dendritik hücreler antijenleri yakalar ve işleme tabi tutar. Olgunlaşmış dendritik hücreler, miyeloid kökenli miyeloid dendritik hücreler ve plasmocytoid (Ienfoid) kökenli plasmocytoid dendritik hücreler olarak ayrılırlar ve bir dizi cevabı başlatırlar. Yabancı antijenleri yakalayan dendritik hüc­reler, bir dizi işleme tabi tutulduktan sonra ve T hücre yayılımı ve farklılaşması için gerekli sinyalleri sağladıktan sonra bu antijenleri sunarlar. B hücreleri aktive etme yeteneğinden dolayı hümoral immüniteyi başlatırlar, doğal katil hücreler (NK cells) ve doğal katil T hüc­releri (NKT cells) gibi doğal bağışıklık hücrelerini aktive ederler. Dendritik hücrelerin bir diğer önemli fonksiyonu da perifer ve timusta immunotoleransı sürdürmektir. Dendritik hücreler aynı zamanda otoimmünitede, çeşitli alerjilerde rol alırlar.

Olgunlaşmamış dendritik hücreler CD11a, CD123 ve CD18 yüzey antijenlerine karşı; olgunlaşmış dendritik hücreler ise CD11c ve CD80 yüzey antijenlerine karşı antikorlar ile inkübe edilerek flow sitometri de analizleri gerçekleştirilecektir.